La nuova era delle terapie a RNA

L’avvento dei vaccini contro il virus Sars-CoV-2 ha definitivamente aperto la via alle innovative terapie a base di varie tipologie di derivati dell’acido ribonucleico (RNA). Se i vaccini terapeutici a base di mRNA promettono di aprire nuove strade nella cura di molti tumori, non mancano molti esempi di terapie già approvate o in via di sviluppo a base di oligonucleotidi antisenso o siRNA.

di Filippo Neri

I tempi evolvono rapidamente, e con essi anche le tipologie di medicinali che escono dalle pipeline delle case farmaceutiche. Non solo i farmaci a base di piccole molecole, anche i medicinali biotech di prima e seconda generazione, come gli anticorpi monoclonali e le terapie cellulari, sono ormai strumenti ben rodati e di uso quotidiano per il trattamento di molte malattie.

L’avvento dei vaccini contro il virus Sars-CoV-2, nel 2021, ha portato alla ribalta una nuova categoria di prodotti, basati su varie tipologie di acido ribonucleico (RNA). Il fattore che distingue medicinali a base di RNA rispetto alle piccole molecole e agli anticorpi monoclonali è la capacità dell’acido ribonucleico di interagire in modo estremamente ampio con proteine, DNA e altri RNA, modulandone gli effetti in un vasto range di azione, dall’attivazione alla totale inibizione delle loro funzioni. Un RNA debitamente progettato nella sua sequenza di basi nucleotidiche, infatti, può teoricamente legarsi alla pressoché totalità dei geni umani, comprese le parti non codificanti proteine, che ne rappresentano la porzione maggiore. Secondo i dati di una review pubblicata nel 2022 su Cell Death and Disease, i farmaci di sintesi chimica e gli anticorpi riuscirebbero, invece, a interagire solo con lo 0,05% del genoma umano. Riepiloghiamo in modo estremamente sintetico e di certo non esaustivo, per ragioni di spazio, le varie tipologie di approcci per la messa a punto di farmaci e vaccini a RNA.

Una storia molto recente

Il mercato delle terapie a RNA rappresentava, nel 2021, il 45% dei 6 miliardi complessivi fatti segnare a livello globale dalle terapie avanzate, incluse anche le terapie geniche e cellulari (ma esclusi i vaccini a mRNA, dati Iqvia).

La comparsa sul mercato delle terapie a base di RNA può essere fatta risalire all’approvazione, nel 1998, di fomivirsen/Vitravene, un oligonucleotide antisenso (ASO) per il trattamento della retinite da citomegalovirus in pazienti immunocompromessi, poi ritirato nel 2002 per mancanza di vendite.

Dopo un salto di una quindicina d’anni, solo a partire dal 2016 sono riprese le approvazioni di terapie a RNA. Tra le più significative, ricordiamo nel 2018 il primo prodotto a base di siRNA, Onpattro/patisiran contro l’amiloidosi ereditaria mediata dalla transtiretina, e nel 2020 i primi vaccini a mRNA per il Covid. Nella categoria degli oligonucleotidi antisenso spicca Spinraza (nusinersen), approvato nel 2017 per il trattamento dell’atrofia muscolare spinale. Tra i prodotti più innovativi vi è la terapia a base di siRNA di Novartis (Alnylam, inclisiran/Leqvio) contro il colesterolo, approvata dall’Agenzia europea dei medicinali nel 2020.

I dati Iqvia riferiti a novembre 2023 indicano nelle malattie cardiometaboliche l’area di maggiore interesse (32%) per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici a base di RNA, in particolare per quanto riguarda i prodotti destinati a trattare malattie del fegato. Fanno seguito l’area oncologica (25%) e il sistema nervoso centrale (21%, figura 1). Tra i prodotti per la cura dei tumori si trovano anche i cosiddetti “vaccini a mRNA” o “vaccini terapeutici”, mirati a sviluppare l’immunità naturale dei pazienti nei confronti di specifici antigeni correlati al tipo di tumore. Proprio le tecnologie a mRNA sono le più rappresentate in area oncologica (32%), seguite dagli oligonucleotidi antisenso (29%).

Guardando ai prodotti in sviluppo (165, ad esclusione dei vaccini profilattici), la maggior parte (58) si trovano in fase II, fase I (43) o ancora in fase pre-clinica (34). Molti studi di fase II sono riferiti a prodotti destinati al trattamento di malattie neurologiche, quali ad esempio l’Alzheimer e altre forme di demenza o la distrofia muscolare. In quest’area, gli ASO sono la tipologia di prodotto più rappresentata (67%).

Molte tipologie diverse di terapie a RNA

Gli oligonucleotidi antisenso sono costituiti da brevi sequenze nucleotidiche che si legano in modo complementare alla sequenza di RNA target, che può anche essere completamente degradata tramite accoppiamento di un ASO a enzimi quali l’RNasi H1. Le diverse tipologie di oligonucleotidi antisenso sono progettate in modo da sortire effetti diversi a livello dei meccanismi su cui vanno ad agire, come ad esempio lo splicing, la sotto- o sovra-regolazione della trascrizione o la rimozione degli RNA messaggeri difettosi.

Sempre alla categoria degli oligonucleotidi appartengono gli aptameri, corte sequenze a catena singola la cui struttura tridimensionale si lega in modo specifico alle proteine target, inibendone il funzionamento. Oltre che agire in modo diretto sulle proteine alla base di una certa patologia, gli aptameri possono anche essere utilizzati anche come vettori per il delivery di altre molecole attive.

Il silenziamento dei geni target è l’obiettivo degli small interferring RNA (siRNA), molecole a doppio filamento debitamente funzionalizzate il cui legame col gene ne blocca il funzionamento. Oltre che per i loro effetti terapeutici, i siRNA sono spesso utilizzati anche per studiare le funzioni di particolari parti del genoma.

Il processo dell’interferenza può essere innescato anche da microRNA (miRNA), molecole endogene a catena singola che si vengono a creare tramite un complesso processo di rottura di precursori più lunghi. Anche in questo caso, il risultato finale dell’azione dei miRNA è la degradazione o la repressione dei geni target.

Nell’attivazione (RNAa), una molecola di RNA a doppia catena (small activating RNA, saRNA) dalla sequenza omologa agisce sulle sequenze promotrici del gene target, innescandone la produzione. Questo tipo di meccanismo può venire utilizzato, ad esempio, per agire sui geni disregolati.

La sostituzione di geni difettosi o mutati è l’obiettivo principale dei prodotti a base di RNA messaggero (mRNA) o RNA di trasferimento (tRNA). L’mRNA è anche alla base dello sviluppo delle nuove tipologie di vaccini, come quelli contro il virus Sars-CoV-2 o altri agenti infettivi. Si parla, in questo caso, di “vaccini profilattici” in quanto somministrati a persone sane e mirati ad aumentare le difese immunitarie dell’individuo, rendendolo così meno soggetto alle infezioni ad opera di agenti microbici. I cosiddetti “vaccini terapeutici”, invece, sono prodotti mirati a rinforzare le difese immunitarie del paziente per permettergli di meglio contrastare un’infezione o un’altra malattia già presenti. Ricadono all’interno di quest’ultima categoria molte immunoterapie di ultima generazione per il trattamento dei tumori, tra cui alcuni approcci a base di mRNA che, una volta iniettati al paziente, entrano nel citoplasma delle cellule per venire tradotti negli antigeni proteici desiderati. Diventa così possibile ripristinare i corretti meccanismi di sorveglianza immunitaria dell’organismo, che portano al riconoscimento delle cellule cancerose come cellule estranee e alla loro conseguente eliminazione ad opera delle cellule immunitarie a ciò preposte (come linfociti T citotossici e macrofagi).

Anche le tecniche di gene editing più innovative, che sfruttano l’approccio noto come CRISPR-Cas9, vedono l’utilizzo di particolari RNA. Questo argomento verrà trattato più nel dettaglio in un articolo successivo di questa serie.

Una sfida per lo sviluppo

Lo sviluppo dei prodotti a base di RNA è stato storicamente frenato da problemi di stabilità della molecola e di bassa efficienza nella sua traduzione. Problemi che sono stati risolti con la messa a punto di tecniche che permettono di funzionalizzare le varie parti che costituiscono l’mRNA (lo prendiamo come esempio) nel suo complesso.

In particolare, la presenza di un cap al terminale 5’ è risultata di fondamentale importanza sia per il riconoscimento che per migliorare la stabilità e l’immunogenicità, grazie a una maggiore protezione dell’acido ribonucleico dall’azione delle nucleasi. Anche la lunghezza della coda di poliadenina presente al terminale 3’, aggiunta in fase post-trascrizione, deve essere attentamente messa a punto, in quanto tale elemento svolge numerose funzioni essenziali, tra cui l’attivazione dei ribosomi che sintetizzano la proteina target. Le regioni non tradotte (UTR) presenti alle estremità 5’ e 3’ del mRNA sono importanti per regolare l’espressione della proteina codificata dalla sequenza nucleotidica, e vanno anch’esse attentamente progettate. L’ultima componente del mRNA sono gli open reading frame (ORF), la vera e propria sequenza codificante per la proteina che si vuole esprimere. Questo elemento può venire modificato ottimizzando la composizione delle sequenze di tre basi nucleosidiche che codificano per i singoli amminoacidi (codoni), modificando alcune basi con introduzione di pseudouridina o altri analoghi nucleosidici o prevedendo l’utilizzo di amminoacidi non naturali.

La sintesi degli mRNA avviene per trascrizione ad opera di enzimi RNA-polimerasi, a partire da una molecola modello di DNA. Segue quindi un passaggio di purificazione, che spesso utilizza metodi cromatografici (per esempio cromatografia ad esclusione, in fase inversa ad alte prestazioni, di affinità, a scambio ionico).

La necessità di veicolare gli mRNA all’interno delle cellule è uno dei passaggi più complessi nella messa a punto di queste nuove terapie, a causa dell’instabilità delle molecole. I prodotti a base di mRNA non necessitano di entrare nel nucleo per dar luogo all’espressione della proteina target (a differenza dei vaccini a DNA): una volta all’interno delle cellule presentanti l’antigene (APC), la produzione di quest’ultimo avviene direttamente nel citoplasma. Gli antigeni così prodotti sono quindi presentati sulla superficie cellulare ad opera delle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità, inducendo la risposta immunitaria dell’organismo e la produzione di anticorpi.

La veicolazione degli mRNA utilizza varie tipologie di sistemi di drug delivery. Le nanoparticelle lipidiche (LNP) con carica positiva sono tra gli esempi più diffusi: la molecola di RNA a carica negativa viene incapsulata al loro interno a formare un cosiddetto “lipoplexe”. Questa tecnologia è stata ampiamente utilizzata, ad esempio, nella messa a punto dei vaccini Sars-CoV-2. Per la realizzazione delle nanoparticelle possono venire utilizzati lipidi variamente funzionalizzati, ad esempio con PEG, colesterolo o fosfolipidi, a seconda delle proprietà che si desiderano ottenere.

Se, invece, si utilizzano polimeri cationici come la polietileneimmina per incapsulare gli mRNA da veicolare, si ottengono i cosiddetti “polyplexes”. Altri esempi possibili di polimeri per la veicolazione di mRNA includono l’acido poli(lattico-co-glicolico) o, per quella dei siRNA, anche chitosano o polimeri di ciclodestrine. Particolarmente innovativi per la loro capacità di superare anche le barriere biologiche, come quella emato-encefalica o cutanea, sono i cosiddetti acidi nucleici sferici (SNA), organizzati attorno a una particella carrier (spesso d’oro o d’argento) a formare un denso strato nanomicellare.

La formulazione dei vaccini a mRNA include anche la presenza di sostanze adiuvanti, finalizzate ad aumentare l’immunogenicità del preparato. A questo riguardo, la letteratura riporta ad esempio l’utilizzo della TriMix, una combinazione di mRNA codificanti per tre diverse proteine immunostimolanti (CD40L, CD70 e TLR4). Anche gli stessi polimeri cationici possono presentare proprietà adiuvanti.

Allo stato attuale, infine, sembrano in gran parte superate le difficoltà legate alla gestione della supply chain dei vaccini a mRNA, che aveva rappresentato una delle principali criticità nel periodo pandemico. Questa tipologia di prodotti non richiede più temperature di conservazione estremamente basse (-80°C circa), come inizialmente stabilito, e può ora essere conservata a 2-8°C.

Sul piano produttivo, le tecnologie a mRNA permettono anche di scalare molto più rapidamente la produzione dei vaccini rispetto ai metodi tradizionali basati sull’utilizzo di batteri o virus inattivati o parti di essi, consentendo una più rapida risposta in caso di pericoli per la salute pubblica. Questo fattore è molto rilevante al fine delle prospettive future di questi prodotti. In questo senso, le previsioni di Iqvia indicano che nei prossimi anni la popolazione di pazienti che avranno accesso alle nuove terapie a RNA è attesa aumentare molto di più rispetto alle terapie geniche e cellulari, che presentano problemi produttivi più difficili da risolvere nell’ottica di produzioni su ampia scala. L’attesa, quindi, è che proprio le terapie a RNA presentino il più elevato potenziale di mercato a lungo termine.